Фаг лямбда

Фаг Лямбда
Зони лізису на культурі клітин E.coli, спричиненні зараженням фагом лямбда
Зони лізису на культурі клітин E.coli, спричиненні зараженням фагом лямбда
Класифікація вірусів
Група: Група I (двониткова ДНК)
Царство: Віруси
Родина: Siphoviridae
Рід: λ-подібні фаги
Вид: Enterobacteria phage lambda
Посилання
EOL logo.svg EOL: 741162
US-NLM-NCBI-Logo.svg NCBI: 10710

Фаг λ (бактеріофаг λ) — це помірний бактеріофаг кишкової палички. Модельний організм генетики, молекулярної біології та біології бактеріофагів. У життєвому циклі фаг лямбда повинен зробити один великий «вибір» — яким шляхом йому розвиватись: літичним, за якого клітина живитель програмується на виробництво нових фагових частинок, а згодом гине вивільняючи в середовище вірусне потомство, чи лізогенний, що полягає у вбудовуванні фагового геному в хромосому бактерії, де він може перебувати тривалий час і передаватись наступним поколінням E.coli. Цей вибір здійснюється на основі відносно простого механізму перемикання генів, що зробило фаг лямбда зручним об'єктом для вивчення регуляції генної експресії. Цей вірус є одним із найдетальніше вивчених живих організмів. [1]

Будова

Будова віріона фага лямбда

Віріон фага λ складається із ікосаедричної голівки діаметром близько 50 нм та хвостового відростка довжиною близько 150 нм, на кінці якого розміщені бокові нитки довжиною 85 нм.[2] Загалом, до складу білкової оболонки фага входить близько 15-ти, білків, що кодуються вірусним геномом.[3]

Спадкова інформація представлена двонитковою лінійною ДНК розміром 48502 п.н. з однонитковими взаємнокомплементарними («липкими») кінцями по 12 нуклеотидів. У геномі фага λ виявлено 75 відкритих рамок зчитування.[4]

Життєвий цикл

Життєвий цикл фага лямбда

Фаг лямбда належить до помірних бактеріофагів. На відміну від вірулентних або літичних бактеріофагів, які після інфекції обов'язково перетворюють клітини на «фабрику» продукування нових віріонів, а згодом руйнують її, помірні фаги мають вибір: за сприятливих умов вони розвиваються літичним шляхом, тобто поводять себе схоже до вірулентних, а за умов нестачі енергетичних ресурсів може реалізуватись інший — лізогенний шлях розвитку, коли фаг перетворюється у латентну «дрімаючу» форму — профаг. За певних умов профаг може активуватись і переходити до літичного розвитку, такий перехід називається індукцією профага.[5]

Під час інфікування кишкової палички бактеріофаг спочатку адсорбується на її поверхні, після чого вводить у цитоплазму свою ДНК. У клітині відбувається експресія невеликої частини вірусних генів, необхідних для прийняття рішення, яким шляхом слід розвиватись. Якщо фаг «вибрав» літичний шлях, більшість його генів активуються, і приблизно за 45 хвилин у бактерії збирається близько 100 нових віріонів, які виходять в середовище руйнуючи клітину живителя.[3]

Натомість під час лізогенного розвитку вірусна ДНК вбудовується у бактерійну хромосому, перетворюючи таку клітину на лізогенну (тобто таку, що за певних умов може стати причиною лізису інших клітин у культурі). Після цього із всього вірусного геному експресується тільки один ген — білка репресора, який пригнічує роботу решти генів. Під час кожного циклу реплікації бактерійної ДНК реплікується і профаг, і кожна дочірна клітина отримує свою копію. У такому стані бактеріофаг лямбда може перебувати необмежений час. Лізогенізація клітини має ще один наслідок: через те, що в її цитоплазмі завжди є певний рівень білка репресора, вона не може повторно інфікуватись фагом того ж типу.

Спонтанна індукція профага, тобто його перехід до літичного розвитку, є дуже рідкісною подією, і відбувається приблизно в одній із 106 лізогенних клітин, цим пояснюється низький рівень вірусних частинок у лізогенних культурах. Проте частоту індукції можна підвищити майже до 100% шляхом опромінення бактерій невеликою дозою ультрафіолету. В такому разі в клітинах вмикається SOS-відповідь, покликана забезпечити репарацію пошкоджень ДНК. Білок-репресор реагує на запуск SOS-відповіді в клітині самознищенням, що має наслідком дерепресію інших генів фага, вирізання (ексцизію) його геному із бактерійної хромосоми, та запуск літичного розвитку. З еволюційної точки зору, це «розумне» рішення, оскільки SOS-відповідь може означати, що клітина живитель має серйозні неприємності, і краще її покинути.

Літичний розвиток

Механізм циклізації ДНК фага лямбда, що відбувається завдяки наявності «липких кінців»[6]

Адсорбція фага λ на поверхні клітини кишкової палички відбувається завдяки взаємодії білка на кінчику хвостового відростка та поверхневого білка LamB бактерії. Після успішного приєднання фаг вводить свою лінійну ДНК у цитоплазму клітини живителя, де вона замикається у кільце: між комплементарними нуклеотидами «липких кінців» утворюються водневі зв'язки, а однониткові розриви «зашиваються» ДНК-лігазами. Ділянка, що утворюється внаслідок перекривання «липких кінців» називається cos-ділянкою, від англійського cohesive ends.

Експресія ранніх генів

Наступною подією в циклі розвитку фага λ є розпізнавання його «ранніх» промоторів PR (правого) та PL (лівого) РНК-полімеразами живителя, які розпочинають транскрипцію. Утворені транскрипти зовсім короткі, оскільки РНК-полімерази, невдовзі по завершенню транскрипції одного гена в кожному напрямку натрапляють на термінаторні ділянки (tR і tL), тому на цьому етапі експресуються тільки два так звані передранні або «негайні ранні» гени: N з лівого промотора і cro — з правого.

Продукт гену N працює як антитермінатор: разом із чотирма бактерійними білками він зв'язується із РНК-полімеразою і модифікує її таким чином, що вона набуває здатності проходити термінаторні ділянки і продовжувати транскрипцію. Модифікуватись може не будь-яка клітинна РНК-полімераза, а тільки та, що зв'язана із спеціальною послідовністю вірусної ДНК — nut (від англ. N utilization). Такі ділянки у геномі фага λ є тільки в двох місцях — перед термінатором tL лівого оперона та перед термінатором tR правого оперона, тому модифікації зазнають саме ті РНК-полімерази, які почали транскрипцію вірусної ДНК. Після цього відбувається експресія всіх генів, що входять до складу ранніх оперонів, найважливішими з них є O та P, які забезпечують реплікацію ДНК.

Спочатку реплікація ДНК відбувається за θ-механізмом (двокерункова реплікація), який забезпечує утворення кільцевих молекул ДНК. Приблизно на 12 хвилину механізм змінюється на «кільце, що котиться», внаслідок чого синтезуються довгі лінійні молекули, що складаються із великої кількості послідовно розташованих копій вірусного геному. Такі молекули називаються конкатамерами і є підходящим субстратом для пакування у фагові голівки.

Експресія пізніх генів

Більшість інших білків продуктів ранніх генів виконують допоміжні функції або беруть участь у виборі літичного або лізогенного шляху розвитку. Один із них необхідний для запуску експресії пізніх генів — білок Q. Схоже до продукту гену N, він виконує роль антитермінатора, хоча біохімічні механізми дії цих білків дещо різні. Пізня транскрипція розпочинається зі промотора PR' пізнього оперона. Цей промотор належить до сильних, тому РНК-полімерази приєднуються до нього відразу після потрапляння вірусної ДНК в клітину, проте транскрипція відразу ж і припиняється, оскільки безпосередньо за PR' міститься термінаторна ділянка. Продукт гену N, не може «розблокувати» транскрипцію в цьому місці, через те, що перед термінатором нема nut ділянки, але наявна послідовність, яка дозволяє білку Q здійснити антитермінацію.

Одночасно внаслідок експресії ранніх генів у клітині накопичується білок Cro, коли його рівень досягає критичного значення, він блокує подальшу транскрипцію власного та інших ранніх генів, оскільки до цього часу їхні продукти вже синтезовані в достатній кількості.

Експресія генів фага лямбда під час літичного розвитку

Пізній оперон містить 26 генів: білків, що складають голівку, хвостовий відросток і бокові нитки віріона, а також ферменти необхідні для лізису бактерії. Голівки і хвостики збираються окремо в цитоплазмі клітини живителя. У кожну голівку запаковується по одній копії вірусного геному, які відрізаються від конкатамеру в cos ділянці, внаслідок чого формуються «липкі кінці». Після цього голівки та хвостики асоціюють, формуючи зрілі інфекційні вірусні частинки, що накопичуються у цитоплазмі. Паралельно в бактерії синтезується білок ендолізин (продукт гену R), та голін (продукт гену S), коли рівень останнього достатньо піднімається, він формує у мембрані клітини пори, що дозволяють ендолізину вийти у периплазматичний простір. Там цей фермент проявляє свою активність і розщеплює муреїн клітинної стінки кишкової палички. Позбавлена опори клітинної стінки бактерія розривається від осмотичного шоку, а вірусні частинки виходять у середовище, готові інфікувати нові клітини.[1]

Вибір між літичним та лізогенним шляхом

Механізм здійснення вибору, яким шляхом розвиватись: літичним чи лізогенним

Передрання та рання транскрипція відбувається однаково, не залежно від того який шлях розвитку обере фаг λ. Здійснення вибору відбувається на рівні білка CII (сі два), що експресується в складі правого оперону після антитермінації білком N, також в цьому процесі задіяний білок CIII (сі три), що входить до складу лівого оперону. Білок CII можна вважати «сенсором середовища», оскільки він відповідає за сприйняття умов всередині клітини живителя, одночасно він є транскрипційним фактором. Коли концентрація CII в клітині досягає потрібного рівня, він активує експресію генів із двох промоторів: PRE (англ. promoter for repressor establishment) та Pi. Обидва промотори є слабкими, і не можуть вмикатись без допомоги CII. Транскрипція, що починається із PRE іде вліво через ген cro (але білок Cro при цьому не утворюється, через те, що ген орієнтований вправо), до гена cI, внаслідок експресії якого утворюється активний білок репресор, який згодом пригнічує експресію всіх інших генів. Pi забезпечує синтез інтегрази, яка відповідає за вбудовування фагового геному до бактерійної хромосоми. Таким чином встановлюється лізогенія.

Рівень білка CII залежить від активності бактерійної протеази FtsH (продукт гену hflB (англ. high-frequency lysogenization by phage λ)), яка його швидко розщеплює.[7] Якби фермент Hfl був постійно активний в клітині, фаг ніколи не зміг би перейти до лізогенії. Проте рівень Hfl регулюється сигнальною молекулою цАМФ: чим вищий в клітині вміст цАМФ, тим нижча активність протеази. Зазвичай багато цАМФ містять клітини, що голодують, в такому випадку активність протеаз падає, відбувається накопичення CII, який переводить клітину на лізогенний шлях. Крім того, накопиченню CII сприяє білок CIII, що пригнічує активність Hfl.

Концентрація CII також залежить від кількості фагів, які одночасно інфікують клітину. Чим більше копій вірусної ДНК потрапляє в бактерію, тим більше відповідно буде синтезуватись CII і CIII, що спрямовуватиме фаг до лізогенного розвитку. Біологічний зміст такої регуляції полягає в тому, що інфікування великою кількістю фагів явно свідчить про те, що віруси в середовищі численніші ніж бактерії, і нові фагові частинки, швидше за все, не зможуть знайти собі незаражену «жертву». В такому випадку вигідніше перейти в латентний стан профага.

«Перемикач» генів

Вплив різних концентрацій лямбда репресора на транскрипцію із промоторів PRM та PR (концентрація збільшується зверху донизу)
Вплив різних концентрацій білка Cro на транскрипцію із промоторів PRM та PR (концентрація збільшується зверху донизу)

Дія сенсора середовища фага лябда, білка CII, зводиться в кінцевому результаті до того, що він регулює вміст в клітині двох факторів транскрипціїCI і Cro, а ці два білки в свою чергу забезпечують перемикання генів. Місцем їх дії є промоторно-операторні ділянки правого та лівого ранніх оперонів, особливо важливе значення має ділянка ORPRMPR. Ця послідовність складається із наступних елементів:

  • PRM (англ. promoter for repressor maintenance) — повернутий вліво промотор, з якого транскрибується ген репресора;
  • PR — промотор правого оперона, повернутий вправо;
  • OR — операторна ділянка, що складається із трьох окремих послідовностей: OR1, яка перекривається тільки із промотором PR, OR3, яка перекривається тільки з промотором PRM, і OR2, що перекривається з обома промоторами, але розташована на одну пару нуклеотидів ближче до PR.

Кожен із білків CI та Cro мають різну спорідненість до послідовностей правого оператора: білок реперсор найбільш ефективно зв'язується із OR1, а до OR2 і OR3 має однакову і нижчу спорідненість, Cro навпаки найбільш споріднений до OR3, і менше — до OR2 і OR1.

Розглянемо ситуацію, коли у клітині високий вміст білка репресора: він приєднається до ділянки OR1, і закриє правий промотор, через що РНК-полімераза не зможе розпочати транскрипцію гену cro, це і є основна функція CI — репресія експресії інших генів. Але наслідки зв'язування білка CI не обмежуються тільки пригніченням правого оперону, одночасно він сприяє кооперативному приєднанню другої молекули CI до OR2. Лямбда репресор у цьому положенні вже діє не як репресор, а як активатор, і стимулює він експресію власного гену: білок CI закриває промотора, але контактує із РНК-полімеразою і сприєя її приєднанню, а отже і транскрипції, з PRM. Для третьої молекули CI кооперативного ефекту не спостерігається, тому ділянка OR3 заповнюється білком репресором, тільки тоді коли його концентрація стає дуже високою. В такому випадку репресор пригнічуватиме і власний ген, його рівень знижуватиметься допоки він звільнить ділянку OR3. Така регуляція за механізмом негативного зворотного зв'язку необхідна для підтримання сталої концентрації лямбда репресора: достатньої для того, щоб не допустити експресії інших генів, і не зависокої, щоб у фага залишилась можливість перейти до літичного розвитку.

Якщо ж у клітині багато білка Cro, то він в першу чергу займе ділянку OR3, виключаючи можливість накопичення репресора. У випадку Cro ніякого кооперативного ефекту не спостерігається, тому для приєднання другої молекули до OR2 потрібна значно вища концентрація білка. На відміну від CI Cro в положенні OR2 не стимулює експресію власного гену, а навпаки — пригнічує. Це пов'язано із тим, що цей білок не має ділянки для взаємодії з РНК-полімеразою, а також із тим, що OR2 розташований ближче до PR ніж до PRM, через що будь-який транскрипційний фактор, чи то CI, чи Cro, приєднуючись до нього перешкоджатимуть зв'язуванню РНК-полімерази із PR. Отже, коли в клітині накопичується достатня кількість Cro він «виключає» роботу раннього правого оперону. Таке явище спостерігається на пізній стадії літичного розвитку, коли нарепліковано вже достатньо копій вірусного геному, і необхідно перевести клітину на виробництво білків капсиду.

Схожим чином Cro і CI впливають на промоторно-операторну ділянку лівого оперну.

Історія дослідження

Естер та Джошуа Ледерберги — мікробіологи, що відкрили фаг λ

Бактеріофаг λ був відкритий випадково 1951 року Джошуа та Естер Ледерберг під час їх досліджень кон'югації бактерій E.coli. Штам K12, який вони використовували, містить у своїй ДНК вбудований «дрімаючий» геном фага лямбда. Ледербегри індукували мутагенез у клітинах кишкової палички, для того, щоб отримати ауксотрофних мутантів. Один із одержаних мутантних штамів втратив профаг лямбда, і через це став чутливий до повторної інфекції. Цей штам вирощували разом із іншим ауксотрофним мутантом, щоб з'ясувати, чи можуть вони доповнювати харчові потреби одне одного. Дослідники отримали несподіваний результат: один із штамів (той, що втратив профага) заразився бактеріофагом від іншого і був лізований. Фаг лямбда став важливим об'єктом досліджень, в першу чергу, через те, що він паразитує на іншому модельному організмі — кишковій паличці. Вже через кілька років після його відкриття стався справжній «бум» експериментів, у яких використовувався цей організм.[1]

Фаг лямбда був одним із перших вірусів, для геному, яких була встановлена повна нуклеотидна послідовність. Секвенування відбувалось під керівництвом Фредеріка Сенґера і завершилось 1982 року.[8]

Джерела

  1. а б в Streips UN, Yasbin RE (2002). Modern Microbial Genetics (вид. 2nd). Willey-Liss, Inc. ISBN 0471386650. 
  2. Information about bacteriophage Lambda на сайті American Society for Microbiology
  3. а б Пташне М (1988). Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг λ. Мир. ISBN 5-03-000854-3. 
  4. Enterobacteria phage lambda, complete genome
  5. Tamarin RH (2001). Principles of Genetics (вид. 7th). Mcgraw-Hill. ISBN 0072334193. 
  6. Nichols BP, Donelson JE (1978). 178-Nucleotide sequence surrounding the cos site of bacteriophage lambda DNA. Journal of Virology 26 (2): 429–34. PMID 666898. 
  7. Shotland Y, Shifrin A, Ziv T, Teff D, Koby S, Kobiler O, Oppenheim AB (2000). Proteolysis of Bacteriophage λ CII by Escherichia coli FtsH (HflB). Journal of Bacteriology. 182(11): 3111–3116. PMID 10809689. doi:10.1128/​JB.182.11.3111-3116.2000. 
  8. Sanger F, Coulson AR, Hong GF, Hill DF, Petersen GB (1982). Nucleotide sequence of bacteriophage lambda DNA. Journal of Molecular Biology 162 (4): 729–773. PMID 6221115. doi:10.1016/0022-2836(82)90546-0. 

Корисні посилання